В XVI столетии Коломенское приобретает всё большее военное и хозяйственное значение. Если ещё в 1521 году крымский хан Мухаммед (Махмет) Гирей беспрепятственно «Коломеньская места повоевав» и «многыя сёла и святые церкви пожегоша» , то в сентябре 1527 года великий князь Василий III с братьями, сформировав здесь войско, выступил в поход к Оке против 40-тысячных орд крымского царевича Ислам Гирея. Переправившись через Оку, русские войска разбили крымскую армию: «В лето 7036 (1527) сентября 5, прииде Ислама царевич крымской, Юсюп царевич Епанчин сын, да два царевича Ахмата Хромого дети и мурзы... многие безвестно к берегу, к Оке-реке,похваляясь, хотя реку перелесть; и князь великий сам противо ево вышел, да стал в Коломенском. А в ту пору воеводы были на берегу не со многими людьми, да стали с Исламом битися об реку крепко... и Ислам отошёл часа того прочь». Это была большая победа русского войска, однако, ненадолго. В 1532 году крымские орды хана Сафы Гирея вновь вторглись в пределы Московского государства. «Выехав, князь великий стал в Коломеньском дожидаться князя Ондрея Ивановича, брата своего и воевод со многими людьми, и тогоже дни прииде весть к великому князю в Коломеньское от воевод с Резани, что Сафа Кирей царь и Ислам царь и иные царевичи со многими людьми пришли на Резань да и посады пожгли; и князь великий часа того послал к воеводам, и велел послать за Оку-реку под люди языков добывать, и воеводы тех татар к великому князю прислали в Коломеньское». К 21 августа крымские орды были разбиты. «Языков», сведения которых помогли отбить татарские полчища, великий князь допрашивал в Коломенском. На миниатюре летописного свода середины XVI века, времени не столь далеко отстоящего от описываемого события, изображены многоверхие великокняжеские палаты и шатровая уже построенная к этому времени церковь Вознесения. Строительство церкви, возможно, было начато осенью 1528 года во время известного «моленного похода» великокняжеской четы по монастырям, а завершено в 1532 году. Как уже упоминалось, предание гласит о том, что храм был возведён в честь наследника великого князя — будущего первого русского царя Ивана IV Грозного. На цветной миниатюре из лицевого свода XVI века с изображением украшения храма «иконами и сосудами церковными» среди трёх икон имеется образ архидьякона Стефана, покровителя дома Глинских, потомков сербского воеводы Стефана Якшича и родственников великого князя, живших в Литве. «Того же лета совершена бысть в Коломеньском церьковь камена Вознесения Господа Бога и Спаса нашего Иисуса Христа.